고위 산업 과학 기술 연구소 [Nakabachi Ryoji 의장 (Nakabachi Ryoji) (이하 "AIST") 생물 의학 연구 부서 [Oamitani Katsuhiro 의장) 뇌 유전자 연구 그룹 최고 연구원 Kitamura Akira, Kitamura Akira, Hokkaido University의 졸업생 교수, 국유 대학교의 회장, 부교수 Yoshizo], Juntendo, School Corporation [Ogawa Hideo 의장], Juntendo University 학교 신경학과 Shimura Hideki 부교수알츠하이머 병아밀로이드 β (바카라 사이트) 단백질
바카라 사이트는 쉽게 중합되어 더 많은 골재를 형성하기 위해 함께 모여 있습니다 바카라 사이트 및 형광 단백질gfp바카라 사이트의 중합에 의해 억제된다 따라서, 생체 내에서 발현 되더라도, 바카라 사이트가 중합 될 때 형광은 관찰되지 않으며, 지금까지 바카라 사이트의 국소화 및 동역학을 시각화하기가 어려웠다 바카라 사이트 및 GFP를 연결하는 아미노산 서열 (링커)을 고안함으로써, 본 발명자들은 바카라 사이트의 중합 상태에 관계없이 GFP 형광의 관찰을 허용하는 융합 단백질을 개발 하였다 또한,이 융합 단백질은 알츠하이머 병의 발달에 관여하는 매우 독성 바카라 사이트올리고머를 형성하는 것으로 밝혀졌습니다
이 기술은 배양 세포 및 살아있는 개인을 사용하여 알츠하이머 병 치료를위한 후보 물질을 선별하고 알츠하이머 병의 발병 메커니즘을 명확하게하는 데 사용될 것으로 예상됩니다 이 성과에 대한 자세한 내용은 2016 년 3 월 16 일입니다과학 보고서잡지에 게시 (디지털 버전, Open Access)
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| 개발 된 바카라 사이트-GFP 융합 단백질 (왼쪽) 및 배양 세포 및 선충 (오른쪽)의 발현의 개략도 |
노화 사회의 배경에서 치매 환자의 수 증가는 의료비 및 현재 간호 시스템의 상태와 관련이 있으며 전 세계적으로 주요 사회 문제가되었습니다 특히 알츠하이머 병은 기억 장애와 판단 능력의 감소입니다혼란가 특징입니다 치매의 절반 이상을 설명하지만, 질병의 발병에 대한 상세한 메커니즘은 명확하지 않았으며 효과적인 치료 또는 치료는 개발되지 않았습니다
10144_10277인산화릴리스타우 단백질신경 세포 내에서 축적Neurofibril 변경및 주요 병리학 적 특징 인 치매는 뇌 위축입니다 비록 이것들이 질병의 원인 일 가능성이 있지만, 알츠하이머 병의 발병 메커니즘은 아직 명확하지 않았다 이러한 맥락에서, 최근 소수의 바카라 사이트 분자에 의해 중합 된 바카라 사이트 올리고머는 세포에 대한 독성이 강하고 세포 내에서의 축적이 질병의 발달에 강력하게 관여한다는 이론이 증가하고있다 그러나, 종래의 방법은 세포 및 뇌 조직의 시편을 사용하여 분석 할 수 있었으므로 살아있는 세포 내에서 바카라 사이트 올리고머 화 상태를 직접 시각화하는 방법과 독성과의 인과 관계에 대한 상세한 분석, 치료 약물에 대한 잠재적 물질, 바카라 사이트 중합의 효과를 직접 분석하기위한 새로운 방법을 필요로했다 따라서 세포 시각화 및 뉴런 기능 분석,트랜스 제닉 동물|형광 상관 분광학Hokkaido University의 Advanced Life Sciences 대학원에서 공동 연구가 수행되었으며, 이는 뛰어난 실적을 보유하고 있습니다
이전에, 바카라 사이트 및 GFP를 연결하는 링커는 12 개 미만의 아미노산으로 구성되었지만, 독성이 높은 이들 올리고머는 바카라 사이트의 형광이 중합 될 때 사라지기 때문에 관찰되지 않았다 이 기사에서, 우리는 바카라 사이트-GFP 융합 단백질 (바카라 사이트-GFP)을 개발했는데,이 기사는 바카라 사이트 및 GFP를 연결하는 링커로서 14 개의 아미노산을 사용하여 바카라 사이트 분자의 중합체가 형성 될 때에도 형광을 관찰 할 수있는 바카라 사이트-GFP 융합 단백질 (바카라 사이트-GFP)을 개발 하였다 이 바카라 사이트-GFP핵 자기 공명 장치, 전자 현미경, 면역 조직 화학 및 형광 상관 분광법을 사용한 분석은 바카라 사이트의 중합이 GFP의 융합에 의해 어느 정도 진행되지 않았으며, 생체 내에서 및 시험관 내에서, 이량 체의 상태에 존재 하였다 이러한 특성을 활용하면 살아있는 세포 내에서 바카라 사이트의 동적 운동과 1 차 배양 뉴런 내 축적 상태를 분석 할 수 있습니다 또한, 올리고머는 중합에서 진행된 바카라 사이트보다 더 많은 독성을 갖기 때문에, 바카라 사이트 올리고머의 중합 정도와 세포에 대한 독성 사이의 관계를 분석 할 수있다
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| 그림 1 : 생체 내 및 시험 관내 바카라 사이트-GFP |
(a) 바카라 사이트 단백질 (A) 및 바카라 사이트-GFP (B, C)의 전자 미세 이미지 바카라 사이트 단백질은 중합을 겪고 섬유질이되는 반면, 바카라 사이트-GFP는 중간 중합을 중간에 중지하여 양의 올리고머를 형성한다 (C에서 점선으로 둘러싸인 부분은 각각 하나의 중합체를 나타낸다)
(b) 바카라 사이트-GFP 표현COS7 CELL(a)에 대해 염색했다 (a) 및 (b)는 대략 우연의 일치이며, 이는 바카라 사이트-GFP가 올리고머임을 나타낸다 |
또한, 바카라 사이트 및 GFP를 연결하는 링커가 짧은 경우, 중합의 효과로 인해 더 이상 GFP의 형광이 관찰되지 않을 것이다 따라서, 본 발명자들은 이번에 발견 한 현상을 사용하여 중합 상태를 감지 할 수있는 시스템을 고안하여 GFP의 형광 강도를 사용하여 후보 치료제를 스크리닝 할 수 있음을 보여 주었다 (도 2) 특정 뉴런에서 GFP 단독을 발현하는 트랜스 제닉 선충에서, 명확한 형광이 뉴런 내에서 관찰 될 수 있지만 (도 2A), 2 개의 아미노산으로 구성된 짧은 링커를 갖는 선충에서, GFP의 형광은 바카라 사이트의 중합으로 인해 관찰되지 않았다 (도 2B) 이 선충은 바카라 사이트의 중합을 억제합니다커큐민를 올린 결과, GFP 형광이 관찰되었다 (도 2c) 따라서, 바카라 사이트-GFP는 형광 강도의 변화를 측정함으로써 바카라 사이트의 중합을 억제하는 약물 발견 후보를 스크리닝하는데 사용될 수있다
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| 그림 2 살아있는 유기체를 사용한 후보 약물 발견 물질에 대한 선별 예 |
| 육종 배지의 선충 (a)이 현미경 하에서 관찰되면, 우리는 Curcumin (b)에 의한 바카라 사이트 중합의 억제로 인해 형광 강도가 증가한 뉴런을 볼 수 있습니다 열린 원은 신경 세포의 세포체를 나타내고 화살촉은 신경 세포의 축삭을 나타냅니다 |
앞으로, 우리는 바카라 사이트-GFP의 형광 강도를 사용하기 위해 배양 뉴런을 사용하여 알츠하이머 질병 치료를위한 후보 물질을보다 쉽게 스크리닝 할 수있는 방법을 개발하기 시작할 것입니다 또한, 개발 된 바카라 사이트-GFP를 발현하는 형질 전환 마우스를 사용하여, 우리는 알츠하이머 병이 시작된 초기에 발생하는 뉴런 내의 작은 변화에 대한 바카라 사이트 올리고머의 효과에 대한 자세한 분석을 수행 할 것이며, 알츠하이머 질병 발달 및 예방 연구의 메커니즘을 계속 조사 할 것이다