새로운 안전한 바카라 사이트 생산 기술을 가능하게하는 발견 된 유전자

IEDA MAKI 교수 (심장학 의학), Sadahiro Ietaro 교수 (심장학 의학), Keio University, Keio University 교수, Keio University 교수, Goto Naoki 조교수, Goto Naoki 조교수, National Institute of Advanced Provention and Technologe의 연구원, National Institution of Advanced Institution의 연구팀, Goto Naoki 조교수로 구성된 연구 그룹 TBX6, 심장 중배엽 세포는 섬유 아세포 및 뮤린 및 인간 다 능성 줄기 세포로부터 직접 유도 될 수있다

현재까지 다중형광 계수^{(주 3)}8629_8870

이 연구에서, 우리는 섬유 아세포로부터 심장 중배엽 세포를 직접 유도하는 유전자 TBX6을 발견했다 또한, 마우스 ES 세포 및 인간 IPS 세포와 같은 다 능성 줄기 세포에 TBX6을 도입함으로써, 우리는 체액 적 인자를 사용하지 않고 효율적으로 증식 할 수 있고 안전한 바카라 사이트 세포 및 혈관 세포를 유도하는 데 성공할 수있는 심장 중배엽 세포를 생성 하였다 이 메커니즘은 TBX6이 심장 발달에 중요한 MESP1 및 BMP4 유전자의 발현을 일시적으로 증가 시킨다는 것이 밝혀졌다 또한, TBX6 발현의 지속 시간을 조정함으로써, 우리는 중배엽과 차별화되는 골격근과 연골 세포가 유도 될 수 있으며, TBX6은 심장뿐만 아니라 꼭두각시 줄기 세포로부터의 전체 중배엽 분화를 조절하는 중요한 요소임을 발견했다

이 연구는 TBX6을 도입하여 체액 적 요인을 사용하지 않고 안전한 바카라 사이트 및 혈관 세포를 생산하는 새로운 방법을 개발했습니다 이 연구 결과는 안전한 바카라 사이트 경색 및 확장 된 안전한 바카라 사이트 병증과 같은 다양한 심장 질환을 재생 의학에 적용 할뿐만 아니라 약물 개발에 기여하는 단순하고 단기적이며 저렴한 안전한 바카라 사이트 생산 기술의 개발에 기여할 것으로 예상됩니다

*이 연구의 결과는 2018 년 8 월 9 일 (일본 8 월 10 일 자정)를 기반으로합니다세포 줄기 세포"

심부전은 전 세계적으로 사망의 가장 큰 원인이며 새로운 치료법이 개발 될 것으로 예상됩니다 안전한 바카라 사이트 세포는 재생 될 수 없기 때문에 심장병으로 인해 심장 기능이 저하 된 심장은 심부전을 유발합니다 ES 세포 및 IPS 세포와 같은 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 안전한 바카라 사이트 세포는 심장 재생 의학 및 약물 개발을위한 도구가 될 것으로 예상되며, 효율적인 안전한 바카라 사이트 유도를 목표로하는 연구가 활발히 수행되고있다 줄기 세포로부터 안전한 바카라 사이트 세포를 유도 할 때, 중배엽 세포 중에서, 특히 심장 중배엽 세포를 통과하는 것으로 알려져있다 이들 세포는 자기 재생 능력을 가지며 안전한 바카라 사이트으로의 높은 분화를 보일뿐만 아니라 혈관 내피 세포를 포함하여 심장 내의 모든 세포로 분화 할 수있다 한편, 줄기 세포로부터 심장 중배엽 세포를 유도하기 위해 다수의 체액 적 인자가 필요하다는 것이 알려져있다 그러나, 이들 제제의 높은 비용 외에도, 유도 과정의 불안정성과 성가성은 심장 재생 의학에 대한 과제였다 또한, 심장 중배엽 유도의 분자 메커니즘 및 선택적 분화를 조절하는 유전자의 존재는 지금까지 명확하지 않았다 따라서, 우리는이 메커니즘을 설명하고 심장으로의 분화를 조절하는 유전자를 발견하면 체액 적 인자를 사용하지 않고 유전자 발현을 제어함으로써 안전한 바카라 사이트 유도를 달성 할 수 있다고 생각했다

이 연구에 앞서 IEDA 교수와 다른 사람들은 GATA4, MEF2C 및 TBX5를 마우스 안전한 바카라 사이트 세포 (IPS 세포를 설정할 때 세포 재편성에 필요한 4 가지 요인 인 "야마 나카 인자"(ieda et al, cell, 2010) 우리는 또한 세 가지 안전한 바카라 사이트 유도 유전자가 마우스 생체 내 섬유 아세포에 도입되어 심장의 섬유 아세포를 안전한 바카라 사이트 세포로 전환 할 수 있다고보고합니다 (Inagawa et al, Circ Res, 2012) 또한, 최근의 연구는 유전자 전달 방법을 개선했으며 세포의 게놈을 손상시키지 않으면 서 단기간에 안전한 바카라 사이트을 효율적으로 유도하는 심장 재생 방법을 성공적으로 확립했습니다 (Miyamoto et al, 세포 줄기 세포, 2018) 그러나,이 방법을 사용하여 생성 된 안전한 바카라 사이트 세포는 증식 능력이 없으며, 도전은 혈관 및 다른 세포를 생산할 수 없다는 것입니다

1 섬유 아세포에서 심장 중배엽 유도제의 스크리닝

CDNA 라이브러리 국립 선진 산업 과학 기술 연구소 (Hupex, Goshima et al 자연 방법, 2008)을 사용하여 심장 중배엽을 유도하는 유전자를 스크리닝했습니다 심장 중간DNA 마이크로 어레이^{(주 4)}데이터를 사용하여, 심장 중배엽에서 특이 적으로 발현 된 58 개의 후보 유전자가 선택되었고, 이들 유전자가 마우스 섬유 아세포에 하나씩 도입되었을 때, MESP1 (그림 1)에 의해 도입 된 세포로부터 만 강화 된 세포의 세포 그룹이 하나의 마우스 섬유 아세포에 하나씩 도입되었다 TBX6에 의해 유도 된 세포는 오랜 기간 동안 심장 중배엽 상태를 유지하였고, 안전한 바카라 사이트과 자연적으로 분화되지 않았으며, 이는 TBX6이 심장 중배엽을 유도하는 유전자임을 시사한다

TBX6은 지금까지 심장 중배엽과 관계를 맺은 것으로 알려져 있지 않지만 마우스 생체 내에서 중배엽 세포입니다단일 Cell-RNA SEQdata^{(주 5)}의 분석 | TBX6을 발현하는 세포는 심장 중배엽 및 심장 전구체 세포를 발현한다는 것을 밝혀냈다 따라서, 심장 발달에서 TBX6의 역할을 조사하기 위해, 우리는 체액 적 인자를 사용하여 마우스 ES 세포로부터 안전한 바카라 사이트 유도 과정에서 TBX6의 역할을 분석하기로 결정했다

결과는 TBX6 유전자가 ES 세포로부터 유래 된 심장 중배엽에서 발현되었음을 확인했다 게다가CRISPR-CAS9^{(참고 6)}를 사용하여 ES 세포에서 부족했을 때, 심장 중배엽 및 안전한 바카라 사이트에 대한 유도는 상당히 억제되었고, TBX6은 살아있는 유기체에서 심장 발달에 중요한 요소 인 것으로 밝혀졌다

2 TBX6 발현 제어 마우스 ES 세포를 사용한 심장 중배엽 및 안전한 바카라 사이트 유도의 확립

TBX6 옆Tet-on Lentiviral System^{(주 7)}를 사용하여 마우스 ES 세포에 도입함으로써 TBX6 유전자 발현을 자유롭게 제어 할 수있는 실험 시스템을 확립했다 우리가 TBX6 발현 단독이 중배엽, 심장 중배엽 및 안전한 바카라 사이트 세포로 이어질 수 있는지 여부를 조사했을 때, ES 세포의 대략 88%가 체액 성인을 사용하지 않고 중배엽 세포로 유도되었다 다른 한편으로, 체액 적 인자를 사용하지 않고 중배엽 세포는 전혀 생성 될 수 없었다 TBX6 발현 하에서 유도 된 많은 중배엽 세포는 심장 중배엽 세포였으며, 이들 중 대략 67%가 안전한 바카라 사이트 세포로 유도되었다 이 유도 효율은 체액 적 요인과의 안전한 바카라 사이트 유도 효율보다 비슷하거나 우수했다 (도 2) 안전한 바카라 사이트 세포 이외에, 본 발명자들은 혈관 평활근 세포와 혈관 내피 세포로의 분화를 확인하고 심장을 구성하는 모든 세포로의 분화를 확인 하였다

3 TBX6 발현에 의한 심장 중배엽 유도 메커니즘의 설명

마이크로 어레이를 사용한 포괄적 인 유전자 분석은 TBX6이 중배엽 및 심장 발달과 관련된 유전자를 상승시키고 신경 생성과 관련된 유전자를 억제하는 것으로 밝혀졌다염색질 면역 침전 방법^{(주 8)}를 사용한 분석 TBX6은 심장 분화에 중요한 MESP1 및 BMP4 유전자에 직접 결합하고, Mesoderm으로의 분화를 억제하여 MESP1 및 BMP4 발현을 유도하는 동시에 SOX2 발현을 억제하는 유전자 인 SOX2를 밝혔다 또한, TBX6은 중배엽 및 안전한 바카라 사이트 유도에 대한 BMP4, 노드 및 Wnt3, 중요한 신호를 유도하고;Paracrine Action^{(주 9)}안전한 바카라 사이트 유도를 촉진하는 것으로 확인되었습니다 이러한 결과는 TBX6이 직접 및 간접 조치를 통해 심장 중배엽을 유도 함을 보여준다

4 TBX6 발현에 의한 마우스 ES 세포에서 골격근 및 연골의 유도 확인

이 연구의 발달 초기에 중배엽의 기능 외에도 TBX6은 골격근과 연골의 기초 인 이성 중배엽의 발달과 관련이있는 것으로 알려져 있습니다 발달 동안, 이들 기관은 심장 이후에 발생하므로, TBX6의 발현 기간이 심장 중배엽의 유도에 필요한 기간을 넘어 확장되었을 때, 이성 중배엽 세포가 생성되었다 또한, 배양 조건을 조정함으로써, 골격근 및 연골 세포는 유도 된 이성적 중배엽으로부터 유도되었다

우리는 또한 동일한 유전자 인 TBX6의 발현 기간이 안전한 바카라 사이트 또는 골격근으로의 분화를 조절하는 메커니즘을 조사하고 TBX6의 발현 기간을 연장하고 안전한 바카라 사이트 분화를 억제하는 유전자 그룹을 유도 함을 밝혀냈다 상기로부터, 우리는 TBX6이 심혈관 및 근골격계 분화를 조절하는 중요한 중배엽 유도 조절제임을 발견했다 (도 3)

5 TBX6 발현 제어 인간 IPS 세포를 사용한 심장 중배엽 및 안전한 바카라 사이트 유도의 확립

다음으로, 본 발명자들은 TET-ON Lentiviral 시스템을 사용하여 동일한 방식으로 인간 IPS 세포에서 TBX6 유전자를 도입함으로써 TBX6 유전자의 발현을 자유롭게 제어 할 수있는 실험 시스템을 확립했다 결과적으로, 우리는 마우스 ES 세포와 마찬가지로, 체계적인 인자를 사용하지 않고 인간 IPS 세포에서 심장 중배엽을 생성 할 수 있으며, 안전한 바카라 사이트 세포 및 혈관 세포로의 분화가 유도 될 수 있음을 확인했다

ES 세포 및 IPS 세포를 포함한 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 안전한 바카라 사이트 세포는 심장 재생 의학 및 약물 스크리닝에 사용될 것으로 예상된다 이 연구에서 개발 된 방법은 안전한 바카라 사이트 유도에 문제가되는 고가의 체액 적 요인을 사용하지 않으며 비용을 약 80%줄일 수 있으며 재생 의학 및 안전한 바카라 사이트 세포 생산에 크게 기여할 것으로 예상됩니다 특히, 약물 발달의 스크리닝에서, 인간 안전한 바카라 사이트 세포를 생산하는 저렴한 방법이 발달하기를 원합니다 앞으로, 우리는이 연구에서 얻은 TBX6 유전자를 사용하여 마우스 및 인간 다 능성 줄기 세포로부터 안전한 바카라 사이트의 유도를 적용 할 것이다 이러한 연구가 저렴하고 안정적인 인간 안전한 바카라 사이트 세포를 제공하기 위해 수행 될 수 있다면, 이것이 심장 재생 의학을 실현하기위한 주요 단계가 될 것이라고 생각합니다

*이 연구는 일본 의학 연구 및 개발 연구소 (AMED)의 네트워크 프로그램, "STEM Cell and Regenerative Medicine Innovation Creation Creation Program"및 "개별 기술 개발 문제", 고급 제약 연구 재단, Takeichi Sankyo Life Science Foundation, Daiichi Life Foundation, Daiichi Sankyo Sankyo Sankyo Sankyo Sankyo Sanko Science Foundation에서 뒷받침되었습니다 Japan Foundation, the Japan Foundation, the Japan Foundation, the Japan Foundation, the Japan Foundation, the Japan Foundation, the Japan Foundation, the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation for the Japan Foundation 일본 일본 재단 재단 일본 재단 일본 재단 일본 재단 일본 일본 재단 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 재단 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단 일본 일본 재단

1. Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D 섬유 아세포를 정의 된 인자에 의해 기능적 안전한 바카라 사이트 세포로 직접 재 프로그래밍합니다 셀; 142 (3) : 375–386, 2010 년 8 월 6 일
2. Inagawa K, Miyamoto K, Yamakawa H, Muraoka N, Sadahiro T, Umei T, Wada R, Katsumata Y, Kaneda R, Nakade K, Kurihara C, Obata Y, Miyake K, Fukuda K, Ieda M GATA4, MEF2C 및 TBX5의 유전자 전달 Circ Res; 111 (9) : 1147-56, 2012 년 10 월 12 일
3. Wada R, Muraoka N, Inagawa K, Yamakawa H, Miyamoto K, Sadahiro T, Umei T, Kaneda R, Suzuki T, Kamiya K, Tohyama S, Yuasa S, Kokaji K, Aeba R, Yozu R, Yamagishi h and gozu Fukuda K, Ieda M 정의 된 인자에 의한 섬유 아세포로부터 인간 안전한 바카라 사이트 세포 유사 세포의 유도 Pro Natl Acad Sci USA; 110 (31) : 12667-72, 2013 년 7 월 30 일
4. Muraoka N, Yamakawa H, Miyamoto K, Sadahiro T, Umei T, Isomi M, Nakashima H, Akiyama M, Wada R, Inagawa K, Nishiyama T, Kaneda R, Fukuda T, Takeda S, Tohyamato S, Kawyame Goshima N, Aeba R, Yamagishi H, Fukuda K, IEDA M MIR-133은 SNAI1을 직접 억제하고 섬유 아세포 시그니처를 침묵시킴으로써 심장 재 프로그래밍을 촉진합니다 Embo J; 33 (14) : 1565-81, 2014 7 월 17 일
5. Yamakawa H, Muraoka N, Miyamoto K, Sadahiro T, Isomi M, Haginiwa S, Kojima H, Umei T, Akiyama M, Kuishi Y, Kurokawa J, Furukawa T, Fukuda K, Ieda M MEda M 정의 된 조건 하에서 심장 재 프로그래밍을 촉진합니다 줄기 세포 보고서; 5 (6) : 1128-42, 2015 12 월
6. Miyamoto K, Akiyama M, Tamura F, Isomi M, Yamakawa H, Sadahiro T, Muraoka N, Kojima H, Haginiwa S, Kurotsu S, Tani H, Wang L, Qian L, Inoue M, kurokawa j, kurokawa j, Aeba R, Yamagishi H, Fukuda K, Ieda M Sendai 바이러스 벡터와의 직접 생체 내 재 프로그래밍은 안전한 바카라 사이트 경색 후 심장 기능을 향상시킵니다 세포 줄기 세포; 22 (1) : 91-103e5; 2018 년 1 월 4 일

주 1) 심장 중피

초기 발달 과정에서 형성된 세포 집단 중 하나 인 Mesoderm은 순환계, 골격계의 공급원, 골격계의 공급원으로 작용하며, 심장으로 구별됩니다 골격근, 연골 등 특히 심장 중개자는 거의 모든 심장 구성 세포, 혈관 정체 및 viscular endethium 및 viscular endethium and visodeculature and viculation chets로 분리된다 근육[참조로 돌아 가기]

참고 2) 다 능성 줄기 세포

자기 재생 능력과 신체를 구성하는 다양한 세포로 구별되는 다중 전위 능력을 가진 세포 배아 줄기 세포 (배아 줄기 세포 : ESCS) 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 (유도 다 능성 줄기 세포 : IPSCS)가 있습니다[참조로 돌아 가기]

주 3) 액체 계수

세포에 의해 방출 된 물질 및 세포 간 분화 및 증식과 관련된 정보를 전송하여 작용한다[참조로 돌아 가기]

주 4) DNA 마이크로 어레이

DNA 칩을 사용하여 많은 유전자를 포괄적으로 분석 할 수있는 방법[참조로 돌아 가기]

Note 5)단일 Cell-RNaseQ

단일 세포 내에서 mRNA의 서열을 해독하여 발현의 정량화를 허용하는 방법[참조로 돌아 가기]

참고 6) CRISPR-CAS9

게놈의 특정 위치에서 유전자 서열의 삭제, 교체 및 삽입을 허용하는 게놈 편집 기술[참조로 돌아 가기]

주 7) Tet-on Lentiviral System

a Docycycline의 존재하에 표적 유전자의 발현을 발현 할 수있는 메커니즘을 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 언제든지 유전자 발현을 조절할 수있는 세포를 생성하는 시스템[참조로 돌아 가기]

주 8) 염색질 면역 침전

단백질과 유전자가 직접 결합되어 있는지 분석하는 방법 이 연구에서, 우리는 TBX6 단백질이 표적 유전자에 직접 결합 된 지 여부를 분석했다[참조로 돌아 가기]

참고 9) Paracrine Action

근처의 세포에 대한 체액 적 요인의 행동[참조로 돌아 가기]