국립 연구 연구소 선진 산업 과학 기술 연구소 [Nakabachi Ryoji 의장 (이하 AIST”로 언급) 생명 의학 연구 부서 [연구 부서 Oamitani Katsuhiro], Molecular Cell Breeding Research Group, Chiga Yukako, Stuforator internation, eMamura Hiroshi, eMamura Hiroshi Ritsumeikan University), 구조 생리 연구 그룹, AIST가 개발 한 부서 부서의 Honda Shinya 수석 연구원 수석 연구원스캐닝 전자 유전체 상수 현미경 (SE-ADM)광범위한 크기와 모양Antibodyagglomerates수용액에서 관찰 될 수있다 또한, SE-ADM으로 얻은 이미지의 분석으로부터, 항체 바카라 규칙가 도시되어있다Fractality프랙탈 치수의 계산이 밝혀졌습니다 골재 형성 메커니즘을 명확히 할 것으로 예상 될 수 있습니다
8788_8923해상도로 건조 또는 염색을위한 전처리없이 측정이 수행 될 수 있음을 보여 주었다 단백질 과학 분야의 기본 연구에서항체 약물의 개발 및 제조에서 광범위한 방식으로 사용될 수 있습니다
이 성과에 대한 세부 사항은 2019 년 3 월 19 일 (Eastern Standard Time)에 제공 될 예정입니다분석 화학에 게시되었습니다 (온라인 버전)
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| 수용액에서 항체 바카라 규칙의 소개 및 이미지 분석 |
암 및자가 면역 질환을 치료하는 데 널리 사용Biopharmaceutical의 품질을 제어하기 위해 바카라 규칙의 분석 기술이 필요했습니다 그 중에서, 항체 약물은 종종 고농도 단백질 용액으로 생산되며, 생산, 저장 및 운송 과정에서 다양한 물리적 및 화학적 스트레스에 노출되므로 바카라 규칙가 발생할 수 있습니다 특히, 정제 단계 및 바이러스 불 활성화 단계에서, 항체 용액이 일정 기간 동안 산성화 된 후 중화 된 처리 (pH 시프트 작동)가 필수적이지만, 중화 될 때, 바카라 규칙가 생성되고 점차적으로 증가한다는 것이 알려져있다 골재는 투여를 방해하고 효능의 감소뿐만 아니라면역 원성의 증가에 대한 우려가 있습니다 환자의 면역 반응을 유발하고 부작용으로 이어질 수 있습니다 바카라 규칙와 면역 원성 사이의 인과 관계는 2014 년에 발표되었습니다FDA 지침또한, 알람이 들렸으며, 바카라 규칙의 적절한 평가 및 관리는 보장 된 효능 및 안전성을 갖는 항체 약물의 개발 및 생산에 필수적이되었습니다
스트레스 요인 등에 따라 항체, 크기 및 모양 변화의 변화를 포함한 단백질 바카라 규칙는 현재 솔루션 조건 하에서 생성 될 수있는 모든 크기의 바카라 규칙를 평가할 수있는 단일 방법이 없으며 크기에 따라 분석 방법이 선택되었습니다 (그림 1) 그러나 이것은 도전이되었으며, 어떤 경우에는 분석 방법 간의 결과를 다른 측정 원칙과 비교할 수 없습니다 또한,주사 전자 현미경 (SEM)수십 개의 NM에서 몇 mm까지 광범위한 샘플을 관찰 할 수 있으며, 샘플을 진공 상태에 배치해야하며, 샘플의 건조 및 염색과 같은 전처리의 영향, 전자 빔이 샘플에 조사되는 것이 우려됩니다
이 배경으로 인해, 자연 상태의 수성 용액에서의 항체와 같은 단백질 바카라 규칙의 관찰 및 응집 시작시 소형 골재로부터 성장 된 바카라 규칙에 이르기까지 광범위한 크기의 항체를 관찰 할 수있는 분석 기술에 대한 요구가 있었다
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그림 1 : 다양한 분석 방법에 적용 할 수있는 입자 크기
진공 조건 하에서 측정되는 용액 조건 및 분석 방법 (파란색)에서 측정되는 주로 분석 방법 (빨간색)이 있습니다 |
AIST는 pH 이동 작업에 의해 인간 단일 클론 항체의 응집 메커니즘을 설명하고 골재를 탐지하고 제거하기위한 기술을 개발하기위한 기술을 개발하고있다 그러나 항체의 응집 메커니즘에 대한 이해를 심화시키기 위해 AIST는 새로운 방법과 새로운 아이디어를 사용하여 연구 개발을 촉진했습니다 이 외에도, 우리는 생명 과학 분야에서 사용할 수있는 현미경 관련 기술을 개발해 왔습니다 이번에는 AIST가 항체와 같은 단백질 바카라 규칙의 성장 과정을 관찰하기 위해 이전에 개발 한 SE-ADM (도 1)을 사용하기로 결정했습니다
또한,이 연구 및 개발은 일본 의학 연구 및 개발 기관 (AMED) 프로젝트의 지원과 함께 차세대 바이오 제조 제조 기술 연구 협회 (Biopharmaceutical Manufacturing Technology Association)의 활동으로 부분적으로 수행되었다 (JP17AE0101003) 또한,이 연구 개발의 일부는 일본 과학 홍보 협회 (JSPS) 보조금 과학 연구를위한 보조금으로 수행되었습니다 (JP15H04365 및 JP17H05829)
2014 년 AIST가 개발 한 SE-ADM은 SEM에 부착 된 반도체 응용 분야에서 입증 된 초박형 필름 기술을 사용하여 만든 샘플 접시를 사용합니다 SE-ADM은 종래의 SEM에 필수적인 탈수 및 샘플 건조와 같은 전처리를 필요로하지 않으므로 건조로 인한 샘플의 변형을 피할 수 있습니다 또한, 전자 빔은 샘플을 직접 조사하지 않기 때문에 전자 빔으로 인해 샘플의 손상이 적습니다 또한, 해상도는 용액에서 생물학적 샘플을 관찰하는 데 일반적으로 사용되는 광학 현미경보다 높으며, 심지어 광학 현미경을 사용하여 상세하게 확인할 수없는 샘플은 높은 배율로 관찰 될 수 있습니다
이번에는 SE-ADM을 사용하여 처음으로 나노 미터의 순서에서 수성 용액에서 인간 단일 클론 항체의 바카라 규칙를 관찰 할 수있었습니다 (그림 2 좌측) 산 스트레스 후 pH 이동 후 샘플을 적용한 후 중성 조건으로 복귀 시켰으며, 이미지는 다양한 크기 및 형태의 바카라 규칙의 존재를 보여 주었다 한편, pH 시프트 조작을 겪은 샘플이 SEM을 사용하여 비교를 위해 SEM을 사용하여 관찰되었을 때, 바카라 규칙는 건조 및 염색과 같은 전처리에 의해 함께 축적 된 것으로 나타났다 (도 2의 오른쪽)
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| 그림 2 현재 방법 (SE-ADM) 및 기존 방법 (SEM)을 사용한 항체 바카라 규칙의 이미지 |
pH 시프트 작동 후 샘플은 3 주에 걸쳐 SE-ADM에서 오랜 시간 동안 관찰되었습니다 (그림 3) 1 일이었던 샘플에서, 대부분의 입자는 20 ~ 70 nm 였지만, 일주일 후에는 수백에서 수천 nm에 도달했으며, 3 주 후에는 수십 μm 이상의 골재가되었습니다 지금까지는 항체 바카라 규칙를 분석하기 위해 샘플의 크기에 따라 다른 분석 방법과 분석기를 사용해야했습니다 또한 샘플의 분석 조건 및 측정 원리는 각 장치마다 다르므로 단순히 장치 간 데이터를 비교하기가 어렵습니다 대조적으로, SE-ADM을 사용하여, 점차적으로 성장하는 바카라 규칙의 과정과 수십 개의 NM에서 수 μM까지의 바카라 규칙의 크기 분포가 동일한 분석 조건 및 분석 장비를 사용하여 포괄적으로 관찰 될 수 있음을 입증 하였다 또한, 캡처 된 이미지 데이터로부터의 크기 측정은 매우 신뢰할 수 있으며, 미세 구조는 ± 20% 이하의 진실성, ± 10% 이하의 정확도 및 50 nm 이하의 낮은 정량화 한계로 정량화 될 수있다
제약 제조업체의 품질 분석 방법으로도 사용크기 제외 크로마토 그래피 (SEC)YA정적/동적 광 산란 방법 (SLS/DLS)바카라 규칙에 대한 크기 정보 만 얻을 수 있지만 SE-ADM을 사용하여 형태 학적 정보를 분석 할 수도 있습니다 오늘날 SE-ADM으로 촬영 한 이미지는 항체 바카라 규칙의 표면이 해안선 맵과 같은 형태임을 보여 주지만, 상세한 이미지 분석은이 그림에 프랙탈 특성이 있음을 보여 주었다 지금까지, SLS 및 DLS를 사용하여 항체는 pH 시프트 작동 후 최대 24 시간 동안 프랙탈 응집 성장을 나타내는 것으로 확인되었지만, 이번에는 100 nm 이상으로 성장한 바카라 규칙의 경우 SLS 또는 DLS로 원칙적으로 측정하기가 어렵다는 것이 입증되었다
프랙탈 치수는 약 175임을 밝혀 냈습니다 기본 물리학에서, 바카라 규칙 형성 메커니즘과 생성 된 바카라 규칙의 프랙탈 치수 사이에 특정 관계가있는 것으로 알려져있다 우리의 결과 25 ℃에서 항체의 응집은 입자 확산의 영향으로 인한 지배적 인 반응임을 시사한다 또한, 프랙탈 치수에 대한 데이터는 일반적으로 SLS 및 DLS로부터 얻은 프랙탈 치수에 대한 데이터와 일치하기 때문에, 항체 바카라 규칙는 몇 가지 NM에서 몇 μM 크기의 단일 메커니즘에 의해 형성되고 성장 될 수 있다고 생각된다
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그림 3 인간 단일 클론 항체의 바카라 규칙의 시간 의존적 관찰
샘플은 pH 이동 절차에 의해 제조되었다 왼쪽으로부터, pH 이동 바카라 규칙를 1 일, 1 주 및 3 주 동안 25 ℃에서 저장 하였다 |
이번에는 SE-ADM이 NM에서 수백 μm의 광범위한 크기의 골재의 형태 및 크기 분포를 분석하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다 또한, 캡처 된 이미지를 분석하여 프랙탈 치수를 계산할 수 있으므로 바카라 규칙의 형성 메커니즘을 설명하는 데 효과적인 것으로 간주됩니다 미래에, 제약의 실제 저장 환경을 재현하고 SE-ADM을 사용한 실제 저장 온도 및 실제 저장 공정에서 항체 응집 발달 및 성장 공정의 장기 관찰을 관찰함으로써, 응집 메커니즘의 표현에 기여할 수 있으며, 이는 항체 계량의 발생을 예측할 수있을 것으로 예상되었다 또한, SE-ADM 이미지에서 프랙탈 치수 및 크기를 분석하는이 방법은 항체뿐만 아니라 다른 단백질의 응집에도 적용될 수 있으므로 단백질 과학 분야의 기본 연구에 기여할 수 있습니다
향후, SE-ADM을 사용하여 액체에서 다양한 항체 바카라 규칙가 관찰 될 것이다 또한, 바카라 규칙는 다양한 조건 하에서 생성되며, 항체 바카라 규칙가 바카라 규칙의 크기와 형태에 따라 발생한다는 물리적 및 화학적 스트레스 사이의 관계가 조사되고, 목표는 기본 지식을 축적하는 것이다 이것은 항체 응집의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이됩니다