미생물의 단백질 생산을 개선하기위한 에볼루션 바카라 서열 설계 기술

국립 연구 연구소 선진 산업 과학 기술 연구소 [Nakabachi Ryoji 의장 (AIST”) 인공 지능 연구 센터 [연구 센터 이사 인 Tsujii Junichi] Ohmics Information Information Discovery Infrructure Division [KAMEYMAMA HITOHIAMA HITOHIAMA HITOHIKO] 혁신 실험실 [실험실 디렉터 Takeyama Haruko] (이하 "CBBD-Oil"이라고 함) Saito Hiroshi, OHMICS 정보 연구 팀 및 약물 발견 인프라 연구 부서 KAMEDA Michifumi, 생물학적 프로세스 연구 부서, 연구 부서 Suzuki Research Group 및 CBBD-OOL, CBBD-OOL, CBBD-OOL Research Strategy Department의 이사 인 Tamura Guhiro Field [지역 책임자 Matsuoka Katsunori] CBBD-Oil은 정보 기술을 기반으로 미생물을 사용하여 단백질 생산을 개선하기 위해 도입 된 에볼루션 바카라 서열 설계 방법을 개발했습니다

미생물을 사용한 물질 생산이 경우, 이종 종의 에볼루션 바카라는 미생물이 본질적으로 가지고 있지 않은 단백질을 생산하기 위해 관심있는 미생물에 인위적으로 도입된다 이 경우, 표적 단백질의 생성을 개선하기 위해, 도입 될 에볼루션 바카라의 DNA 서열을 적절하게 설계하는 과정 (코돈최적화)가 중요합니다 코돈 최적화에 대한 전통적인 연구는 주로 대장균과 같은 실험을 쉽게 수행하는 연구 미생물에 중점을 둡니다Actinomycetes와 같은 생물 산업 재료 생산 현장에서 사용되는 미생물에 대한 확립 된 코돈 최적화 기술은 없었다 이번에는 AIST의 대규모 단백질 생산 실험 데이터의 분석을 통해 규칙을 추출하여 새로운 코돈 최적화 방법을 개발했습니다Rhodococcus actinomycetes로 입증되었습니다 이 기술을 사용하여 설계된 에볼루션 바카라 서열은 원래 서열의 시작 부분에 돌연변이 만 포함하므로 낮은 실험 비용으로 합성 될 수 있습니다 이번에 개발 된 기술은 의료, 식품 및 환경과 같은 다양한 분야를 가능하게 할 것입니다바이오 제조가속화 될 것으로 예상됩니다

이 결과는 2019 년 6 월 6 일 (영국의 주간)에 게시되었습니다과학 보고서에 게시되었습니다

정보 기술 에볼루션 바카라 서열 설계 단백질 생산 증가

최근 몇 년 동안, 미생물을 사용한 물질 생산은 관심을 끌었으며, 제약 및 기능성 식품 및 바이오 연료를위한 원료 생산을 포함한 다양한 응용이 있습니다 미생물이 원하는 물질을 생성하도록하는 방법은 미생물이 본질적으로 가지고 있지 않은 단백질을 생산하기 위해 다른 종의 에볼루션 바카라를 표적 미생물에 인위적으로 도입하는 것이다 이 경우, 표적 단백질의 생성을 개선하기 위해, 도입 된 에볼루션 바카라의 DNA 서열을 설계하는 과정이 중요하다 이 서열 설계는 단백질의 아미노산 서열이 변하지 않도록 DNA 서열에서 코돈 사용 패턴을 최적화하는 설계이기 때문에 "코돈 최적화"라고 불린다

전통적인 코돈 최적화에서 관심있는 미생물이 사용됩니다전체 에볼루션 바카라도입 될 에볼루션 바카라에서는 효과적이지만 대규모 실험 데이터를 기반으로 생산을 개선하는 데 실제로 효과적인 지에 대해 자세히 검증하는 연구는 거의 없었다 최근에, 이러한 연구는 대장균 및 기타 그러한 연구에서 점차적으로 수행되기 시작했지만,이 발견이 다른 미생물에 적용될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않으며, 생물 지적의 재료 생산 현장에 사용 된 많은 다양한 미생물이 코돈 최적화 방법을 확립하지 않았다

Actinomycete의 유형,Rhodococcus errythropolis(Rhodococcus erythropolis)는 4 ~ 35 ° C의 넓은 온도 범위에 걸쳐 성장할 수 있으며 유기 용매에 대한 저항성 및 지방족, 방향족 및 이종 사이 클릭 화합물을 변환하는 생체 촉매 활성을 포함하여 많은 특징을 갖는 미생물입니다 E Coli와 같은 일반 목적 호스트와는 매우 다른 특성으로 인해 차세대 호스트 후보로 전 세계적으로 예상됩니다 그러나, Rhodococcus erythropolis에 대한 코돈 최적화 방법은 확립되지 않았으며, 이는이 미생물의 적용에 장애물이었다

AIST는 재료 생산에서 Rhodococcus erythropolis 사용에 대한 지속적인 연구를 수행했으며 그 유용성과 안전성을 입증했습니다 (AIST의 주요 연구 결과 2014 년 7 월 1 일) 특히, 우리는 다수의 에볼루션 바카라에 대한 단백질 생산 실험을 수행했으며 Rhodococcus erythropolis는 세계에서 가장 큰 데이터를 가지고 있습니다 또한 대규모 데이터 분석을 통해 유용한 결과를 추출하기위한 연구를 수행했습니다 이번에는 AIST의 이러한 강점을 결합하고 Rhodococcus erythropolis에 적용 할 수있는 새로운 코돈 최적화 방법을 개발하는 작업을 수행했습니다

또한,이 연구 및 개발은 국가 연구 개발기구의 지원을 받아 "NEDO (National Research and Development Corporation New Energy and Industric Development Organization)가 계약 한 공장 및 기타 유기체를 사용한 고성능 생산 기술 개발"국가 연구 개발기구의 지원으로 수행되었습니다

AIST는 Rhodococcus erythropolis 균주 L-88을 발표했다Streptomyces CoelicolorA3 (2)로부터 유래 된 에볼루션 바카라가 도입되는 단백질 생산 실험 데이터를 포함한다 이 데이터는 204 개의 에볼루션 바카라의 에볼루션 바카라 서열 및 단백질 생산 부피에 대한 데이터이며, 이들의 분석을 수행 하였다 에볼루션 바카라 서열의 다양한배열 기능| 계산되었고, 단백질 생성과 서열 특징 양 사이의 상관 관계를 평가 하였다mRNA의 2 차 구조 형성andCAI(코돈 적응 지수)는 단백질 생산과 높은 상관 관계를 보여 주었다 이들 결과를 바탕으로, 우리는 2 차 구조를 어렵게 만들고 CAI를 증가시키는 에볼루션 바카라 서열의 팁 부분 만 변경하는 코돈 최적화 기술을 개발했다 (도 1) 이 기술은 다음 절차를 사용하여 단백질 생산을 증가시키는 데 최적으로 간주되는 서열을 만드는 것이 포함됩니다

(1) 코돈 사용 패턴만이 원래의 에볼루션 바카라 서열에 대해 동일한 11 개의 아미노산 서열에 따라 코돈 사용 패턴만이 변하는 모든 에볼루션 바카라 서열 (mRNA 서열)이 컴퓨터에서 생성된다
(2) 각 에볼루션 바카라 서열의 시작 및 11 코돈의 CAI에 대한 전사 시작점에서 11 번째 코돈까지의 2 차 구조 형성 정도를 계산한다
(3) 모든 배열의 경우, 지정된 임계 값보다 높은 CAI를 갖는 시퀀스는 2 차 구조를 획득하기에 가장 어려운 시퀀스를 검색하고 최적의 시퀀스의 후보로 사용됩니다

AIST가 보유한 실험 데이터를 분석함으로써 에볼루션 바카라 서열의 첫 번째 부분은 단백질 생산에 중요하다는 의미입니다 일반적으로, 하나의 아미노산은 평균 3 개의 코돈을 가지므로, 예를 들어 50 개의 아미노산 잔기로 구성된 작은 단백질에 대한 코돈 사용 패턴을 변화시키는 전체 에볼루션 바카라 서열은 3⁵⁰≒ 72 × 10²³방대한 수의 거리 (약 1 억 x 1 억 x 1 억 x 1 억 x 1 억 x)는 컴퓨터에서 배열을 만들 수 없습니다 (그림 2) 이 결과로, 코돈 사용 패턴에 대한 변화 범위는 에볼루션 바카라 서열의 상단 부분, 대략 10 개의 코돈으로 좁혀 졌으므로 코돈 사용 패턴의 변화를 갖는 총 서열의 수는 3¹⁰≒ 59,000 방법과 계산이 가능하여 실행 가능한 방법을 개발할 수있었습니다 (그림 1)

그림 1이 시간에 개발 된 방법을 사용한 코돈 최적화 개요

그림 2 : 에볼루션 바카라 서열의 첫 부분이 아니라 코돈 최적화가 전체적으로 수행 될 때

이번에 개발 된 코돈 최적화 방법의 효과를 확인하기 위해, 최적의 서열은 12 개의 에볼루션 바카라 (서열 길이 100 내지 400 아미노산)에 대해 설계되었고 단백질 생산을 평가하기 위해 Rhodococcus erythropolis에 도입되었다 결과적으로 9 개의 에볼루션 바카라 (75%)야생형 시퀀스에 비해 생산량이 향상되었습니다 (표 1) 특히, 야생형 서열에 의해 작은 단백질을 생성하는 5 개의 에볼루션 바카라에 대해, 모든 에볼루션 바카라의 생산량은 본 방법을 사용하여 설계된 서열에 의해 개선되었다 (도 3; TETR 전사 인자의 예) 이 결과는이 방법이 생산하기 어려운 단백질에 특히 효과적이라는 것을 보여줍니다 또한,이 방법은 단백질 생산을 개선 할뿐만 아니라 생산량을 낮추는 데 효과적이었습니다 이러한 검증에서, 단백질 생산 실험은 12 개의 에볼루션 바카라 각각에 대해 10 개의 에볼루션 바카라 서열을 사용하여 3 회 수행되었다 (12 에볼루션 바카라 x 10 서열 x 3 회 = 360 실험) 이것은 이전 코돈 최적화 연구와 비교하여 매우 대규모 실험이며, 검증 된 현재 방법은 신뢰성이 높은 것으로 간주됩니다

표 1이 방법을 사용하여 설계된 에볼루션 바카라 서열을 사용하여 단백질 생산 개선의 유효성 검증 결과

그림 3 서열 설계에 의한 발현 수준의 개선 예 (단백질 전기 영동에 의한 발현 분석)

이 방법은 전체 에볼루션 바카라 서열이 아닌 첫 번째 부분 만 변경하므로 설계된 서열을 합성 할 때,전장 에볼루션 바카라 합성돌연변이 유학 프라이머를 갖는 PCR간단하고 저렴한 방식으로 합성 될 수 있다는 이점이 있습니다 또한, 미생물을 표적으로하기 위해 CAI를 적응시킴으로써, 이들이 대장균과 같은 Rhodococcus 속 이외의 다양한 미생물에서 단백질 생산에 적용될 수있는 가능성이있다

이번에 개발 된 기술은 다양한 미생물에 의해 단백질 생산에 적용되어 효과를 입증하고 재료 생산의 효율성을 향상시킬 것입니다 또한 단백질 생산을 줄일 수 있기 때문에 재료 생산의 정확한 제어를위한 기술로 개발 될 것입니다

◆ 미생물을 사용한 바이오 제조, 물질 생산

바이오 제조업은 생물을 사용하여 의약품과 같은 인간에게 매우 가치있는 물질을 생산하는 것이 포함됩니다 원하는 재료 생산 능력을 제공하기 위해, 실험적으로 다루기 쉽고 단백질의 질량 생산에 적합한 유기체에 기초하여 다른 종에서 재료 생산을위한 다양한 에볼루션 바카라를 인위적으로 도입 할 수있다 이 종의 기초 인 종을 "숙주"라고합니다 박테리아와 같은 미생물은 재료 생산을위한 숙주로 널리 사용됩니다[참조로 돌아 가기]

◆ 코돈

에볼루션 바카라의 DNA 및 RNA 서열을 구성하는 3 개의 염기의 부분 서열 3 개의 염기는 단백질의 하나의 아미노산 잔기에 해당한다 한 유형의 아미노산에 대한 다수의 상응하는 코돈이 있기 때문에, 아미노산 서열을 변화시키지 않으면 서 DNA 및 RNA 서열의 코돈 사용 패턴을 변화시킬 수있다 예를 들어, 글리신에 해당하는 4 가지 유형의 코돈이 있습니다 : GGA, GGC, GGG 및 GGU[참조로 돌아 가기]

◆ Actinomycetes

미생물은 박테리아 (원핵 생물 미생물) 및 진핵 생물 미생물로 광범위하게 나눌 수 있습니다 actinomycetes는 세포가 길고 실 모양의 형태로 자라는 작은 박테리아 범주 중 하나입니다 생물 산업 물질 생산 현장에서 널리 사용되는 Streptomyces와 Rhodococcus 속은 Actinomycetes의 구성원입니다[참조로 돌아 가기]

◆ Rhodococcus actinomycetes, Rhodococcus erythropolis

Actinomycete의 유형 그것은 수많은 재료 생산으로 전 세계적으로 관심을 끌고 있습니다[참조로 돌아 가기]

◆ 전체 에볼루션 바카라

종이있는 에볼루션 바카라 물질 생산을 위해 도입 된 이종 에볼루션 바카라와 구별하는 데 사용되는 용어[참조로 돌아 가기]

◆ 배열 기능

다양한 지표를 사용하여 에볼루션 바카라 서열의 특성을 정량화하여 얻은 값[참조로 돌아 가기]

◆ mRNA의 2 차 구조 형성 정도

배열 기능 중 하나 살아있는 신체에서 단백질의 생산에서, mRNA라는 분자는 먼저 에볼루션 바카라의 DNA로부터 합성 된 다음 단백질이 mRNA로부터 합성된다 mRNA의 2 차 구조는 4 가지 유형의 mRNA 염기 (a, c, g, u)의 상호 작용에 의해 형성된 구조이다 이번에는 특징량은 컴퓨터 예측을 사용하여 계산 된 2 차 구조의 용이성의 인덱스 (⊿G)였습니다 높은 ⊿g 서열은 2 차 구조를 포착하기가 어렵고 생체 내 단백질 합성을 수행하는 리보솜 분자에 결합 할 가능성이 높으며 단백질 생산을 개선 할 것으로 예상된다[참조로 돌아 가기]

◆ CAI

배열 기능 중 하나 코돈 적응 지수에 대한 약어 에볼루션 바카라 서열의 코돈 사용 패턴이 숙주 유기체의 내인성 에볼루션 바카라에서 코돈 사용 패턴과 얼마나 잘 일치하는지 확인하기 위해 0에서 1까지 평가 된 값 높은 CAI 서열은 숙주 종에 거의 사용되지 않는 코돈 (희귀 코돈)을 포함하지 않기 때문에 단백질 생산을 개선 할 것으로 예상된다[참조로 돌아 가기]

◆ 야생형 시퀀스

코돈 최적화에 의한 변형 전 에볼루션 바카라 서열 이종 종으로부터 유래 된 에볼루션 바카라의 경우, 그것이 유도 된 종의 원래 에볼루션 바카라 서열[참조로 돌아 가기]

◆ 전장 에볼루션 바카라 합성

지정된 에볼루션 바카라 서열과 DNA의 인공 합성[참조로 돌아 가기]

◆ 돌연변이 유학 프라이머가있는 PCR

특정 에볼루션 바카라 서열을 갖는 DNA에 기초하여 변형 된 서열의 일부만으로 다른 DNA를 합성하는 방법 서열 변형의 부위에 상응하는 짧은 DNA (프라이머)를 사용하여, 서열 변형 된 DNA는 PCR이라는 방법을 사용하여 증폭 될 수있다[참조로 돌아 가기]