고위 산업 과학 기술 연구소 [Nakabachi Ryoji 의장] (이하 AIST ", 환경 관리 연구 부서 [Tanaka Mikiya 의장), Kin Seibai 최고 연구원 및 Keio University [의장 Haseyama Akira] (Keio University [Keio") Kohei], 응용 화학과, 코지 명예 교수, Daniel Chitterio 교수 및 응용 화학의 Nishihara Ryo (박사 프로그램),Bioluminescent Enzyme에 매우 밝은 빛을 방출하는 일련의 기판을 성공적으로 합성했습니다
일반적으로 생물 바카라 주소 효소는 일반적으로 동일합니다빛나는 기판를 공유하는 것은 상식이었습니다 예를 들어, 파이어 플라이를 포함한 곤충에서 유래 한 생물 바카라 주소 효소는 일반적으로D- 루피 페린8561_8587BioAssay둘 이상의 생물 바카라 주소 효소를 사용하기가 어렵습니다 예를 들어, 둘 이상의 생물 바카라 주소 효소가 공통 기판의 빛을 방출 할 때, 서로의 방출 스펙트럼은 겹쳐서 방출 신호의 오염을 유발합니다 기존의 광학 필터에서는 빛나는 신호를 완전히 분리하기가 어렵고, 빛나는 휘도를 분리 할 수 있다고해도 빛나는 휘도가 약화된다는 문제가 있습니다 생물 분석에서 다수의 바카라 주소 효소를 동시에 사용할 수 있다면, 높은 샘플 처리 기능을 포함하여 생물 분석 효율을 크게 증가시킬 수있다
공동 연구팀은 기존의 지혜를 뒤집는 새로운 도전으로, 바카라 주소 효소에 대해 선택적으로 빛을 방출하는 분자 바카라 주소 기판을 성공적으로 설계하고 개발했습니다 결과적으로, 생물 분석에서 일반적으로 사용되는 Renilla (Renilla루시퍼 라제; rluc) 유형 및 바카라 주소 플랑크톤 파생인공 생물 바카라 주소 효소(인공 루시퍼 라제; ALUC®9209_9248과학 보고서잡지 (Nature Publishing Group)에 2017 년 4 월 19 일 판에 온라인으로 게시되었습니다
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| 살아있는 동물 세포 (아프리카 녹색 원숭이의 신장에서 유래)를 사용한 생체 바카라 주소 영상 실험 다양한 바카라 주소 효소를 발현하는 형질 전환 세포를 마이크로 슬라이드에서 배양 하였다 이 연구에서 개발 된 바카라 주소 기판이 모든 마이크로 슬라이드에 뿌려 지더라도 특정 바카라 주소 효소 만가 켜진다는 것을 알 수 있습니다 비교에 사용 된 광 방출 효소 : Gluc, 가우스 생물 바카라 주소 효소; Rluc86-535, Renilla bioluminescent 효소; ALUC16, 인공 생물 바카라 주소 효소; Cluc, 성게 생물 바카라 주소 효소; FLUC, FIREFLY BIOLUMONESCENT ENZYME; CBG, 녹색 쌀 두개골 생물 바카라 주소 효소 그룹 1 및 그룹 3은 그림의 분류 표에서 그룹을 나타냅니다 2 (a) |
Firefly Luminescence 대표bioluminescence주로 생물 분석에 널리 사용됩니다 반딧불은 생물 바카라 주소의 두드러진 예이지만 바카라 주소 플랑크톤 및 랑데부와 같은 다른 많은 바카라 주소 유기체가 자연에 살고 있습니다 이러한 생물 바카라 주소은 일반적으로 신체에 무해하지만 밝고 광학 필터가 필요하지 않으므로 검출 장치의 소형화에 유리하며 생물 분석 및 다양한 진단 키트의 바카라 주소 레이블로 오랫동안 사용되어 왔습니다
반면에, 형광등은 산업과 대학에서 바카라 주소뿐만 아니라 바카라 주소 라인테이션으로 널리 사용되는 바카라 주소 레이블입니다 해파리로부터 분리 된 형광 단백질은 특히 잘 알려져있다 그러나, 내 형광 신호를 유도하기 위해서는 여기 빛과의 조사가 항상 필요하다 그러나, 형광은 여기 빛의 작은 부분이 형광 신호로 변하고 나머지 신호의 대부분이 백그라운드에 남아 있기 때문에 매우 비효율적 인 시스템입니다 또한, 여기 광의 일부는 형광 신호에 의해 오염 될 수 있으며, 강한 여기 광 조사 (일반적으로 레이저 사용)로 인한 생물학적 파괴의 문제도있다 따라서 배경 형광은 항상 높으며 항상 여기 라이트 발진기와 광학 필터가 장착되어 있어야 감지 시스템을 복잡하게 만듭니다 이러한 한계 외에도 자극 조명 (예 : 살아있는 신체 깊은), 독점적 인 지방 분해 환경 (배아, 지방 조직 등)과 같은 높은 형광 배경을 가진 시스템 및 소형 진단 시스템 (예 : 미니 아티 아화)을 가진 시스템에서 사용하기 어려운 문제가있었습니다
생물 바카라 주소은 오랜 역사에도 불구하고 산업적 사용을 방해하는 몇 가지 약점을 가지고 있습니다 예를 들어, 생물 바카라 주소은 형광과 다르고 방출 스펙트럼 (반 값 너비)가 두껍기 때문에 (그림 1 (a)), 다른 바카라 주소 신호 사이의 오염 (crosstalk)이 발생할 수 있습니다 또한, 빛 방출에는 기질이라 불리는 화학 물질이 필요하지만, 바카라 주소 효소에 사용될 수있는 바카라 주소 기판은 거의 없어서 여러 다른 바카라 주소 효소가 동일한 바카라 주소 기질로부터 빛나는 문제를 초래한다 예를 들어, 파이어 플라이를 포함한 곤충에서 유래 한 바카라 주소 효소는 일반적으로 공통 기질로서 d- 루시 페린을 사용합니다 유사하게, Renilla를 포함한 해양 유기체로부터 유래 된 바카라 주소 효소는 종종 Coelenterazine을 일반적인 기질로 사용한다 예를 들어, 대부분의 바카라 주소 색상은 청록색 영역에서 빛을 발산하고 노란색보다 긴 파장에 대해 빛을 발산하는 경우가 거의 없습니다 드문 경우에는 붉은 빛이 방출되는 경우 (예 : 철도 곤충)가 있습니다 이 경향은 특히 해양 유기체에서 유래 한 바카라 주소 효소에 대해 특히 강합니다
이 생물 바카라 주소 기능 (두꺼운 반 넓이, 제한된 바카라 주소 색상)으로 인해, 바카라 주소 신호 사이의 특정 수준에서의 오염은 둘 이상의 바카라 주소 효소로 구성된 바이오 시스템에서 불가피하다고 생각되었다 이 문제를 해결하기 위해 광학 필터를 사용하여 색상을 분리 할 수 있지만,이 경우 빛의 빛이 크게 줄어들고 감지 광학 시스템은 단점이 있습니다
이러한 문제는 생물 바카라 주소이 사용될 때 자주 발생하며, 생체 바카라 주소이 사용되는 한 피하기가 매우 어려운 것으로 간주되었습니다
이 연구는 Scientific Research Foundation A, Foundation B 및 도전적인 배아 연구 (위의 과학 촉진 협회)의 연구 지원을 통해 수행되었습니다
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| 그림 1 (a) 전형적인 생물 바카라 주소 효소의 방출 스펙트럼 그것은 주로 청록색 영역에서 빛을 방출하지만 기판과의 조합에 따라 600 nm 이상의 적색 파장 영역에서 빛을 방출합니다 (B) 해양 유기체에서 유래 한 생물 바카라 주소 효소의 초 고등성 3 차원 구조 (RLUC, 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC30)) 각 바카라 주소 효소의 결합 모델은 동일한 기질에 대해 상이합니다 (Coelenterazine (CTZ)) |
우리의 공동 연구팀은 위에서 언급 한 기본 문제에 대한 솔루션으로서 각 바카라 주소 효소에 대해 구체적으로 빛을 방출하는 기판을 개발하기 위해 노력하고 있습니다
첫째, 빛나는 플랑크톤 (copepod) (그림 1 (b); 참조 용지 1)에서 유래 한 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC®)의 초 고도도 3 차원 구조에 중점을 두었습니다 이 구조적 분석은 다음을 밝혀냈다 : 효소 활성 부위는 C- 말단에 가깝다 또한, "기질의 C-2 잔기"는 효소 활성 부위에서 비교적 깊다는 반면, "기질의 C-6 잔기"는 효소 활성 부위의 입구 근처에 위치한다 이것은 "기질의 C-2 잔기"가 효소 활성 부위에 단단히 결합하는 동안, 기질의 C-6 잔기 "가 비교적 느슨하게 결합한다는 것을 시사한다 한편, 이전에 알려진 RLUC8의 형태는 반대였다 "기판의 C-2 잔기"는 느슨하고 "기질의 C-6 잔기"는 효소 활성 부위에 고체적으로 결합되었다 (참조 2)
생물 바카라 주소 효소의 이러한 구조적 특징은 바카라 주소 효소에 특이적인 바카라 주소 기질 인 "기질의 C-2 또는 C-6 잔기"를 조절함으로써 생성 될 수 있음을 시사한다
따라서,도 2 (a)에 도시 된 바와 같이, 20 가지 유형의 바카라 주소 기질이 합성되었고, 동물 세포에서 발현 된 바카라 주소 효소를 사용하여 이들의 바카라 주소 특성을 조사 하였다 결과적으로, 결과는 그림에 도시된다 2 (b)가 얻어졌다 즉, 각 바카라 주소 기질은 각 바카라 주소 효소에 대해 상이한 선택성을 나타낸다 예를 들어, 바카라 주소 기판 ②, ③ 및 ④는 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC®)로부터 특정 빛을 방출하는 반면, 바카라 주소 기판은 선택적으로 레 닐라 광 바카라 주소 효소에 대한 바카라 주소만을 방출한다 (RLUC86-535) ALUC® 및 RLUC86-535는 강한 바카라 주소을 방출하는 것으로 밝혀졌습니다
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| 그림 2 (a) 합성 된 바카라 주소 기판의 화학 구조 붉은 색은 원래의 바카라 주소 기질 (기본 Coelenterazine)과 다른 기능 그룹입니다 (b) 합성 된 바카라 주소 기질에 의한 바카라 주소 효소의 상대 바카라 주소 강도 편의를 위해 합성 바카라 주소 기판은 화학 구조에 기초하여 5 가지 범주로 나뉩니다 : 그룹 1에는 C-6 위치에 에티 닐 그룹이 포함됩니다 그룹 2의 특징은 C-2 페닐 고리에 하이드 록실 (OH) 그룹을 갖는 것입니다 Sea Firefly Luminescent Enzyme (RLUC86-535)에 특이적인 바카라 주소 기판 (6PIOH-2H-CTZ)은 C-2 위치에 기능적 그룹이없고 C-6 위치에 OH 그룹이 없다는 사실을 특징으로한다 |
도 2의 결과는 많은 바카라 주소 효소가 공존하는 복잡한 시스템에서 하나의 바카라 주소 효소가 선택적으로 방출 될 수 있음을 보여준다 이들 결과에 기초하여, 동물 세포주에서 유사한 결과를 얻을 수 있는지 확인하기위한 실험이 수행되었다 먼저, 아프리카 녹색 원숭이의 신장으로부터 유래 된 COS-7 세포를 6 개의 채널 마이크로 슬라이드에서 배양하고, 각 바카라 주소 효소를 발현시켰다 그림과 같이 3, 각 채널에서 6 개의 상이한 바카라 주소 효소가 발현되는 3 개의 마이크로 슬라이드가 제조되었다 기판 (③, ⑮, ⑨))는도 1의 선택성을 나타낸다 이어서, 2는 3 개의 마이크로 슬라이드에 도입되었다 바카라 주소 기판 ③는 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC16)가 선택적 바카라 주소을 방출하도록 유발했다 한편, Renilla 바카라 주소 효소는 광 바카라 주소 기질로부터의 바카라 주소을 선택적으로 방출한다 그러나, 우리는 바카라 주소 기판 ⑨가 첨가 될 때, 이들 모두가 사실상 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC16)가 더 강하게 방출 될 것으로 예측했다 이러한 결과의 차이는 세포 용해 시스템 (도 2)과 살아있는 세포 시스템의 고유 특징에 의해 설명 될 수있다 (도 3) 예를 들어, 살아있는 세포주에는 세포막이 있으며, 세포막을 통해 스며드가 쉽고 투과하기 어려운 바카라 주소 기판이있어 바카라 주소 밝기에 영향을 미칩니다 세포 용해 시스템에서, 반응 용액의 pH는 산성 영역으로 설정된다 이전의 연구는 이미 산성 pH가 인공 생물 바카라 주소 효소의 밝기를 더 강하게 억제한다는 것을 보여 주었다 따라서, 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC16)와 Renilla 바카라 주소 효소의 휘도는도 2의 실험에서 유사한 것으로 보인다
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| 그림 3 (a) 살아있는 동물성 세포 환경에서 바카라 주소 기질의 바카라 주소 효소에 대한 선택적 생물 바카라 주소 영상 어떤 바카라 주소 기판이 분무되는지에 따라, 특정 바카라 주소 효소가 선택적으로 빛날 것이다 (b) 시간이 지남에 따라 살아있는 동물 세포의 생물 바카라 주소 휘도의 변화 Renilla bioluminescent 효소 (RLUC86-535; 세포질에 국한된)는 바카라 주소 밝기를 빠르게 잃는 반면, 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC16; 소포체)가 증가한 후 바카라 주소 밝기에 국한된 후 (나중에 Luminescence) 증가합니다 이 결과는 세포질에서의 국소화의 차이로 인한 것으로 보인다 즉, 인공 생물 바카라 주소 효소에 대해 선택적 바카라 주소 기질은 세포 막에 두 번 스며 들고 내 혈관 성 망상에서 바카라 주소 효소를 충족함에 따라 상위 및 아래의 바카라 주소 바카라 주소을 나타낸다 이 실험에 사용 된 바카라 주소 효소의 유형 : 가우스 생물 바카라 주소 효소 (GLUC); 바다 반딧불이 생물 바카라 주소 효소 (RLUC86-535); 인공 생물 바카라 주소 효소 16 (ALUC16); 바다 반란 생물 바카라 주소 효소 (CLUC); Fireflies Bioluminescent Enzyme (FLUC); 쌀 딱정벌레 생물 바카라 주소 효소 녹색 (CBG) |
이 연구에서 개발 된 바카라 주소 기판의 특정 바카라 주소 효소 선택성을 검증하기 위해,보다 복잡한 생물 분석 시스템이 그림 4에서 설계되었습니다 첫째, 두 가지 유형의 연구 그룹이 이전에 개발되었습니다분자 변형 센서동일한 동물 세포에 도입되어 발현되었다 각각의 분자 변형 센서는 인공 생물 바카라 주소 효소 (ALUC23) 및 RENILLA 생물 바카라 주소 효소 (RLUC8)를 함유한다 이 센서가 리간드에 결합 될 때, 센서 분자의 단백질 사이의 결합이 발생하므로, 그들 사이에 샌드위치 된 바카라 주소 효소가 변형되고 바카라 주소 밝기가 증가한다 (스위치 1이라고 함) 또한이 연구에서 개발 된 바카라 주소 기판을 추가함으로써 하나의 센서 만 선택적으로 조명 될 수 있습니다 (스위치 2라고 함) 즉, 많은 스위치 1이 공존하는 복잡한 시스템에서도 스위치 2 (선택적 기판)에 의해 빛을 선택적으로 호출 할 수 있습니다 이 결과는 동일한 방출 스펙트럼을 갖는 많은 방출 센서가 공존하는 시스템에서도 각 방출 신호가 정확한 지점에서 빛을 발휘할 수 있음을 보여줍니다
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이 연구는 생물 바카라 주소의 근본적인 도전, 즉 바카라 주소 오염을 해결 한 결과입니다 이 결과를 사용하여, 소형 생물 분석 키트는 많은 수의 호르몬과 생리 학적 활성 물질을 동시에 측정하는 상용화 될 수 있습니다 Prior Art는 한 번에 하나의 바카라 주소 신호 만 감지 할 수는 있지만,이 연구의 성공으로 인해 오염없이 한 번에 여러 바카라 주소 신호를 측정하는 고효율 바이오 세이 키트를 실현할 수있었습니다 또한, 영향을받는 영역의 다색 영상은 다수의 바카라 주소 효소를 사용하여 고효율로 달성 될 수있다
이 결과를 바탕으로, 우리는 훨씬 더 높은 성능 바카라 주소 기판을 합성 할 계획입니다 예를 들어, 더 긴 파장에서 빛을 방출하는 바카라 주소 기판이 개발 될 수 있다면, 바카라 주소 신호의 조직 투과성이 개선 될 것이다 우리는 인공 생물 바카라 주소 효소의 3 차원 구조를 설명함으로써, 이것은 생물 바카라 주소이 가진 바카라 주소 반응을 이해하는 데 중요한 단서를 제공하기를 희망한다
국립 선진 산업 과학 기술 연구소, 국립 연구 개발 공사
환경 미생물학 연구 그룹, 환경 관리 연구 부서
최고 연구원 Kim Seibai 이메일 : kimu-sb * aistgojp ( @로 변경하고 보내주세요)