세계 최고의 열 안정성 효소 (바카라 족보 Ligase)

이시카와 카즈히 코 (Ishikawa Kazuhiko), Nedo Fellow, Zensho, Nedo Fellow, Nedo Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Yoshikawa Hiroyuki 회장) (이하 "AIST")의 특수 인간 연구 기관 (Taguchi Takahisa 회장)은 다음과 같습니다친수성 고고 박테리아(원시 박테리아라고도 함)Aeropyrum Pernix의 게놈 정보 사용 (Aeropyram Pernix), 우리는 표적 유전자의 약간의 차이를 탐지하고 증폭시키기 위해 적용될 수있는 초경기 ​​내성 바카라 족보 리가 제 (2 개의 바카라 족보 단편에 결합하는 효소)를 성공적으로 개발했다

열 내성 바카라 족보 리가 제는 유전자 돌연변이로 인한 질병 진단을 위해 개발 된 효소입니다 이번에 개발 된 열 내성 효소는 기존 효소에 비해 내열성을 상당히 개선했으며 100 ℃에서 매우 안정적이며 105 ℃에서의 반감도 1 시간이었다 이 효소를 사용함으로써, 표적 유전자의 검출 시간은 기존의 방법보다 약 절반이 될 것이며, 감도는 100,000 배 증가 할 것으로 예상된다

현재, 대량의 게놈 정보가 공개되었으며, 폴리머 라제 연쇄 반응은 그 정보를 최대한 활용합니다 (중합 효소 연쇄 반응: PCR)는 분자 생물학 연구 분야의 표준 기술 중 하나가되었습니다 또한 유전자 돌연변이로 인한 질병을 진단하는 데 사용될 수 있습니다리가 제 연쇄 반응 (리가 제 연쇄 반응: LCR) 메소드또한 고안되어 단지 한 기저의 돌연변이를 쉽게 증폭시키고 감지 할 수 있으며, 이는 다른 방법을 사용하여 짧은 시간 내에 검출하기가 어렵습니다

바카라 족보 리가 제는 2 개의 바카라 족보 단편의 말단에 결합하는 효소이며, 열 내성 바카라 족보 리가 제는 LCR 방법에 필수적이다 현재 LCR 방법에 사용되는 열 내성 바카라 족보 리가 제는 약 95 ℃에서 약 95 ℃에서 효소 활성에서 절반으로 절반으로 반응한다

이번에는 열 내성 바카라 족보 리가 제가 95 ℃에서 효소 활성의 감소를 나타내지 않았다고 발표했다 또한, 100 ℃에서 몇 시간 동안 효소 활성의 감소가 관찰되지 않았으며, 105 ℃에서의 효소 활성의 반감기는 약 1 시간이었다 LCR 방법에서, 이중 가닥 바카라 족보는 고온 (94 ℃ 이상)에서 분리되어야하므로 효소가 고온에서 안정적 일수록 더 바람직하다 이 효소는 기존 효소보다 매우 높은 내열성을 가지기 때문에 LCR 방법의 광범위한 사용을 포함하여 광범위한 용도를 가질 것으로 예상됩니다

오늘날 AIST에 의해 개발 된 열 내성 바카라 족보 리가 제는 이전에 알려진 바카라 족보 리가 제보다 더 강력합니다 따라서 LCR 방법은 고온에서 광범위한 응용 분야에서 사용될 수 있습니다 LCR 방법에 사용될 때, 검출 시간은 종래의 효소에 비해 약 절반 만 감소 될 수 있으며, 검출 감도는 약 100,000 배 증가시킨다

이번에 AIST의 발달은 고열성 고고의 게놈 정보로부터 알려진 바카라 족보 리가 제에 대한 상 동성 인 유전자를 발견했다 유전자를 클로닝하고 효소를 대장균으로 제조 하였다 기능 분석은이 효소가 기존 바카라 족보 리가 제 사이에서 가장 높은 내열성을 갖는 것으로 밝혀졌다

이 사실은 게놈 정보만으로 예측할 수는 없지만 실제로 효소 제조 및 기능 분석을 수행 한 결과로 배운 것입니다

LCR 방법에 사용 된 열 내성 바카라 족보 리가 제는Stratagene(Stratagene)PFU 바카라 족보 LigaseandEpicenter(진원지)Ampligase 바카라 족보 Ligase의 두 가지 유형이 있지만, 효소 활성은 약 95 ℃에서 약 1 시간 동안 절반으로 절반으로 반복된다 이번에 AIST에 의해 개발 된 효소는 그러한 온도에서 활동을 감소시키는 것으로 관찰되지 않았다

AIST는 이전 에이 유용한 효소 (일본 특허 출원 번호 2003-045224)에 대한 기본 특허를 제출했습니다 또한 자세한 연구 결과는 International Journal of Molecular Biology (Febs Letters) (2003 년 8 월 28 일)에 발표되었습니다 AIST는 미래 에이 효소의 새로운 응용 프로그램을 개발하는 데 집중할 계획입니다

질병 진단의 원래 중요한 사용 외에도, 미량 샘플 만 이용할 수있는 경우에도 유전자 증폭 기술의 가능성과 사업 가능성은 그 안에 포함 된 중요한 유전자를 증폭, 발견 및 정량화하는 것과 같은 끝없는 확장 될 것입니다

◆ 초기성 고풍

Arbacillus (원시 박테리아라고도 함)는 고대 지구에서 살아남은 유기체로 여겨지며 "진핵 생물"(인간, 조류, 물고기, 효모, 시금치 등) 및 "Eugebacteria"(예 : Coli)와 함께 세 번째 범주의 유기체를 언급합니다 지난 10 년 동안 해저 및 기타 지역의 열수 퇴적물에서 차례로 발견되었습니다 고열성 고고가 보유한 효소는 대부분의 다른 효소가 변성 및 비활성화 될 때 약 100 ° C에서도 생화학 적 반응을 촉매 할 수있어 미래 산업을 구축하는 데 중요합니다 다시 말해, 효소를 사용한 생화학 적 반응이 약 100 ° C에서 발생하는 다양한 반응 과정에 도입 될 수 있다면, 고효율 및 고 가치가있는 새로운 산업이 생성 될 것으로 예상됩니다
95 ° C 근처에서 성장하는 초기 유성 고고선Aeropyrum Pernix(Aeropyrum pernix)가 카가 고시마 현 근처의 물에서 발견되었으며, 그 게놈은 일본에서 완전히 해독되었습니다 AIST의 특별 인간 연구 분야는 응용 프로그램을 개발하기 위해 주도권을 잡고 있습니다 이 업적은 한 가지 예입니다[참조로 돌아 가기]

◆ Ligase 연쇄 반응 (리가 제 연쇄 반응: LCR) 메소드

리가 제 연쇄 반응 (리가 제 연쇄 반응: LCR)는 열 내성 바카라 족보 리가 제를 사용하여 온도 사이클링 반응 (열처리 및 냉각의 반복 반응)을 수행함으로써 표적 유전자 서열을 증폭시키고 검출하는 방법이다
이 방법에서, 반응은 2 개의 인접한 유전자 단편 (도 2, 황색)을 포함하여 4 가지 유형의 유전자 단편을 사용하여 수행된다 구체적으로, 이중 가닥 바카라 족보는 94-99 ℃에서 열 처리되어 각각 단일 가닥으로 분리된다 (도 1) 50-70 ℃에서의 후속 냉각 작동은 2 개의 인접한 유전자 단편이 단일 가닥으로 분리 된 표적 바카라 족보에 결합하도록 유발한다 (도 2, 밝은 청색) (도 2, 노란색) 또한, 서열이 정상 인 경우, 인접한 유전자 단편은 열 내성 바카라 족보 리가 제 (도 2, 보라색) (그림 2, 왼쪽)에 의해 연결되어 있지만 한 바닥에도 이상이 연결되어 있지 않으면 연결되어 있지 않다 (도 2, 오른쪽) 이 일련의 반응을 반복함으로써, 정상적인 바카라 족보 서열의 경우, 유전자 단편의 결찰 생성물은 기하 급수적으로 증폭되지만 (도 3, 왼쪽), 비정상적인 바카라 족보 서열은 증폭되지 않았다 (도 3, 오른쪽)

 

그림 1

그림 2

그림 3

이 방법에서는 94-99 ° C에서 가열하여 이중 가닥 바카라 족보를 단일 가닥으로 분리해야하므로 이러한 고온에서도 비활성화되지 않은 바카라 족보 리가 제가 필요합니다 기존의 바카라 족보 리가 제를 95 ℃에서 60 분 동안 유지할 때, 이들의 활성이 절반으로 감소되어 효율이 크게 감소 할 것이다
LCR 방법은 "유전자 증폭 기술"중 하나이며 그 특징은 다음 두 가지 점입니다
(1) 높은 특이성으로 인해, 유전자 서열의 한 지점에서의 돌연변이가 검출 될 수있다 결찰 반응은 인접한 유전자 단편의 말단이도 2에 도시 된 바와 같이, 왼쪽, 왼쪽 및 정상 바카라 족보 증폭은이 생성물을 주형으로 사용하여 발생한다 (도 3, 왼쪽) 반면에, 두 유전자 단편의 말단의 경계 부위에있는 한 염기에 비정상이있는 경우, 결찰 반응은 발생하지 않으며 비정상적인 바카라 족보는 증폭되지 않을 것이다 (도 2, 3, 오른쪽) 이것은 둘 사이의 명확한 구분을 허용하여 비정상적인 바카라 족보의 진단을 허용합니다
(2) 또 다른 것은 그것이 매우 민감하다는 것입니다 핵산을 증폭시키는 종래의 방법에서, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR), 30 개 이상의 사이클 동안 온도 사이클링, 비특이적 핵산은 노이즈를 증폭시키고 유발할 수 있지만 LCR 방법은 50 내지 70 사이클에서도 특정 핵산 증폭을 허용한다 따라서 소량의 샘플조차도 오류없이 분석하고 분석 할 수 있습니다[참조로 돌아 가기]