국립 선진 산업 과학 기술 연구소 [Ishimura Kazuhiko의 의장] (이하 AIST ") 건강 의료 공학 연구 부서 [연구 부서 Tatsu Yoshiro 이사 인 Tatsu Yoshiro] Molecular Combined Physiology Research Group Miyagi Masaru, Biomedical Researchi의 이사 및 Biomedical Research의 국립 연구 개발 기관 구조 약물 발견 연구 그룹 Kato Yoshio, 연구 그룹의 이사 등은 다음과 같습니다Genomeedit효소CAS9에 단단히 결합하는 핵산 분자 및 제어 효소 활성 (Nucleic Acid Aptamer) 또한,이 핵산 aptamer를 세포에 도입함으로써, 바카라 하는 법 편집 효소의 활성이 제어 될 수 있으며, 우발적 인 바카라 하는 법 편집 (오프 표적)을 억제 할 수 있으며, 이는 지금까지 문제가되어보다 정확한 바카라 하는 법 편집이 가능하다는 것이 입증되었다 이 기술은 분자 생물학 연구, 유전자 요법 및 육종과 같은 바카라 하는 법 편집 기술이 사용되는 다양한 분야에 기여할 것으로 예상됩니다 또한 2020 년 10 월 30 일핵산 연구잡지에 게시 (디지털 버전, Open Access)
이번에 개발 된 핵산 앱 타머는 우발적 인 바카라 하는 법 편집을 억제 할 수 있습니다
최근에 유전자 서열을 다시 작성하는 바카라 하는 법 편집 기술은 생물학 및 제약 분야에서 많은 관심을 끌었으며 2020 노벨 화학 상을 수상했습니다 이 기술은 바카라 하는 법 편집 효소를 사용하여 세포의 바카라 하는 법 서열을 다시 작성 (편집)하고 유전자 요법, 육종 및 의료 기술을 포함한 다양한 적용 연구가 수행되고 있습니다 그러나, 바카라 하는 법 편집 (외부 표적)에 의해 야기 된 바카라 하는 법 서열의 우발적 돌연변이 및 결실의 발생은 안전성을 보장하는 데 중요한 과제이다
AIST는 이전에 핵산 앱 타머를 획득하기위한 고유 한 기술을 만들었습니다 (시험 관내 선택 방법)를 개발하고 있으며, 엑소 좀 (세포 외 소포)을 인식하는 핵산 앱 타머와 같은 다양한 표적 분자에 결합하는 핵산 앱 타머를 획득했습니다 이번에는, 우리는 바카라 하는 법 편집 효소 CAS9를 표적으로하고 시험 관내 선택 방법을 사용하여 스크리닝하여 높은 결합 능력 및 억제 활성을 갖는 핵산 앱 타머를 수득 하였다
또한,이 연구 개발은 국가 연구 개발 기관이 계약 한 "플랜트 및 기타 유기체 (2016-2019)를 사용한 고성능 생산 기술 개발 프로젝트의 지원으로 수행되었습니다
표적화 된 효소 CAS9 단백질을 사용하여 시험 관내 선택에 의해 핵산 라이브러리로부터 CAS9 단백질에 결합하는 핵산 서열을 선택 하였다 CAS9 단백질에 결합 된 핵산 서열에서 다수의 후보 핵산 서열을 찾기 위해 차세대 시퀀서에 의해 대규모 서열 분석 및 정보 분석을 수행 하였다 이들 후보 핵산 서열 중에서, 지수로서 CAS9의 효소 활성을 사용하여 2 차 스크린을 수행하였고, 효소 활성을 억제하는 핵산 서열 (핵산 aptamer)이 발견되었다 상세한 분석은이 핵산 aptamer가 CAS9의 바카라 하는 법 DNA- 결합 영역과 가이드 RNA CRRNA에 결합하고, 이들 결합은 억제 활성에 기여한다는 것을 시사한다 또한이 핵산 aptamer가 세포에 도입 될 때 세포 내 바카라 하는 법 편집을 제어 할 수 있음을 확인 하였다 또한, 핵산 (LNA) 사용은 세포 내 핵산 aptamer 활성을 상당히 향상시켰다 (도 1)
우리가 핵산 aptamer에서 우발적 인 돌연변이 및 결핍을 억제하기 위해 개발 한 핵산 앱 타머의 효과를 평가하기 위해, 우리는 HEK293 세포에 EMX1 유전자좌를 표적화하는 CAS9/SGRNA 플라스미드를 도입하고, 10 시간 및 2 일 후에 핵산 aptamer를 도입 하였다 5 일 후 세포를 수확하고, 추출 된 DNA의 서열 분석을 차세대 시퀀서에 의해 수행하여 표적 외 부위에서보고 된 서열 돌연변이 (Indels)를 조사하고, 억제 효과 (억제 속도)를 계산 하였다 핵산 앱 타머가 적절한 시간에 세포에 도입 될 때, 바카라 하는 법 편집 효소 CAS9에 의해 표적 오프 표적 부위에서 생성 된 비 특이 적 바카라 하는 법 편집은 표적 부위에서의 특정 바카라 하는 법 편집보다 약 25 배 더 많은 것을 억제 할 수 있음을 발견했다 (도 2) 우리가 개발 한 핵산 앱 타머로 바카라 하는 법 편집 효소를 제어함으로써, 외부 표적 부위에서 바카라 하는 법 편집의 발생을 억제하여보다 정확하고 안전한 바카라 하는 법 편집을 허용 할 수있다
이번에 개발 된 핵산 aptamer의 설계 개념은 CAS9 (CAS3, CPF1 등) 이외의 다양한 CRISPR 패밀리에도 적용될 수 있으므로 억제제가 발견되지 않은 바카라 하는 법 편집 효소와 관련된 다양한 응용 분야가 예상됩니다
그림 1 : 핵산 앱 타머에 의한 세포 내 바카라 하는 법 편집 제어
핵산 aptamer를 세포 내로의 도입은 바카라 하는 법 편집 (왼쪽)을 겪은 세포 수 (빨간색)를 감소시킨다 변형 된 핵산 LNA를 사용한 핵산 aptamer가 사용될 때, 거의 모든 바카라 하는 법-편집 된 세포가 사라졌다 (오른쪽) 왼쪽 그림에서, HEK293 세포로 Cas9/CRRNA 복합체의 도입은 바카라 하는 법에 삽입 된 발현 조절 DNA 영역에서 바카라 하는 법 편집이 발생하고, 다운 스트림 형광 단백질의 발현은 세포를 적색으로 보이게한다 왼쪽 상단과 오른쪽의 다이어그램은 셀 분류기를 사용하여 개별 세포의 특성을 보여줍니다 수평 축은 형광 염료의 양을 나타내고, 수직 축은 세포의자가 형광의 양을 나타냅니다
그림 2 : 비특이적 바카라 하는 법 편집의 억제 효과 (외부 표적)
CAS9의 다른 부위에 결합하는 또 다른 핵산 앱 타머가 분석됩니다 우리는 바카라 하는 법 편집 효소의 다른 부위에 결합하는 다중 핵산 앱 타머를 개발하고 다양한 기능의 바카라 하는 법 편집 기능을 제어하는 기술을 구축하고자합니다