전자 ​​기계 천공 방법 (전자 기계적 포로)에 의한 바카라 필승법로의 분자 소개 촉진

최근 몇 년 동안, 거대 분자와 장쇄 DNA를 살아있는 바카라 필승법에 도입하는 것은 많은 관심을 끌었다 바카라 필승법막 천공 기술은 바카라 필승법 내에서 발현 된 생체 분자의 활성을 시각화 할뿐만 아니라 유전자 조작을 허용한다 예를 들어, 일반적인 드릴링 기술로전기 천공^{참고 4)}, 단백질, 핵산 등은 이제 바카라 필승법에 도입되어 유 전적으로 조작 할 수 있습니다 유전자 편집을위한 가장 강력한 도구CRISPR-CAS 시스템^{주 5)}바카라 필승법 내로, 바카라 필승법 내 게놈의 모든 표적 표적 유전자를 조작 할 수있다 일반적으로 CRISPR-CAS 시스템은 큽니다Expression Vector^{참고 6)}(> 10 kbp)에 의해 코딩되었습니다 큰 분자를 바카라 필승법에 도입함으로써,보다 진보 된 유전자 조작은 유전자 변형 조작의 효율을 향상시킬 수있다 그러나, 종래의 전기 천공은 1 내지 100 nm 범위의 막 기공을 생성 할 수 있지만, 많은 양의 게놈 정보를 가진 큰 분자가 다양한 바카라 필승법 유형에 도입 될 수 있는지는 확실하지 않다

이 연구에서, 우리는 유전체로 덮인 미세 전극으로 구성된 코어 쉘 구조를 갖는 마이크로 버블 인젝터를 사용하여 유전자 전달 기술을 개발했다 이 기포 인젝터는 바카라 필승법에 두 가지 물리적 자극 (전기 및 기계적 자극)을 허용합니다 기포를 생성하기 위해 장치에 펄스 전압을 적용 할 때, 기포 인젝터의 팁은 전기 공포에 사용 된 것과 동등한 전기장 (수 MV/m)을 생성 할 것으로 예상되며 전기장은 셀 막의 천공을 유발할 것으로 예상된다 또한, 전압이 적용될 때 생성 된 기포의 진동 및 분쇄로 인해 기계적 자극이 바카라 필승법에 적용된다 따라서,이 연구 그룹은 전기 기계적 기초를 확립하기 위해 노력했으며, 전기장 자극과 기포에 의한 기계적 자극을 동시에 로딩함으로써 전기 천공을 포함한 이전 도입 방법보다 더 높은 도입 효율로 기초 기술을 실현할 수 있다고 생각했다

이 연구에서, 바카라 필승법 현탁액의 점도를 증가시킴으로써, 마이크로 버블은 반복적으로 확장되고 수축되어 바카라 필승법로의 유전자 전달 효율을 증가시킬 수있다 그림 1은 구성된 전자 기계적 기초 실험을위한 플랫폼을 보여줍니다 표적 분자를 함유하는 셀 현탁액에 삽입 된 기포 인젝터 사이에 펄스 전압이 적용될 때, 전극 전극을 포함하는 셀 현탁액에 전기장이 농축되어 현탁액에서 미세 기포가 발생합니다 (그림 1) 이 시점에서, 기포 주변의 유체는 바카라 필승법 현탁액의 점도에 따라 두 가지 방식으로 행동하며, 유체 거동에 따라 현탁액 변화에서 바카라 필승법에 대한 기계적 자극 정도 (연구 결과의 개략도) 낮은 점도 현탁액의 경우, 생성 된 기포는 장치 끝에서 순차적으로 배출되어 컨테이너 내의 순환 흐름을 초래합니다 (Microtube) 이때, 바카라 필승법는 흐름을 따라 움직이고, 비교적 작은 기계적 자극, 주로 유체 전단력에 적용된다 반면에, 높은 점도 현탁액의 경우, 기포는 인젝터 끝에서 반복적으로 확장되고 수축됩니다 이것은 바카라 필승법 현탁액의 점도가 높을수록 끌어 가고 미세 기포의 방출을 방지하기 때문입니다 이 연구에서, 본 발명자들은 현탁액의 점도를 증가시키기 위해 바카라 필승법와 두껍게의 농도를 증가 시켰으며, 기포의 진동을 현탁액으로 전파함으로써 바카라 필승법에 대한 압력 진동으로 인해 비교적 큰 기계적 자극을 적용 할 수 있었다

제안 된 유전자 전달 방법의 효과를 입증하기 전에 전원의 출력 전력을 최적화했습니다 21 × 10⁵바카라 필승법/μL의 NIH/3T3 바카라 필승법 현탁액 (분자 소개 실험에서 7 μL)을 사용하여, 출력 전력은 4 내지 15W로 변하였고, 플라스미드의 형질 도입 효율 (도입시 형광을 나타내는 PEGFP-N1)을 전자 역학적 용기에 의해 비교 하였다 출력을 12W로 증가시키는 것은 형질 감염된 바카라 필승법의 수를 증가시키는 동시에 형질 감염된 바카라 필승법의 수를 추가로 15W로 증가시키는 것으로 밝혀졌다 12W에서, 바카라 필승법 생존력은 대략 60%였다 한편, 15W에서, 바카라 필승법 생존율은 약 25%로 감소 하였다 또한 12W에서 플라스미드 상태를 확인했을 때 큰 손상이 발생하지 않았습니다 이들 결과는 12W의 출력이 바카라 필승법 유전자 전달에 가장 효과적이며, 후속 실험에서는 12W의 출력 전력이 적용되었음을 시사한다

다음으로, 우리는 증가 된 점도가 기계적 자극을 향상시키는 데 효과적인지 여부를 결정하기위한 실험을 수행했습니다 상이한 바카라 필승법 농도에 의한 현탁액의 점도 평가는 바카라 필승법 농도가 증가함에 따라 전단 점도가 증가 함을 나타냈다 (도 2) 다음으로, 우리는 다양한 농도에서 마이크로 버블의 거동을 관찰했으며, 낮은 바카라 필승법 농도에서 생성 된 기포는 순환 흐름을 초래하는 반면, 높은 바카라 필승법 농도에서는 기포가 장치의 끝에서 진동하고 순환 흐름이 발생하지 않았다는 것을 발견했다 이러한 결과는 점도가 기포 거동에 영향을 미치고 변화하는 용매 조건이 분자 도입을위한 기계적 자극을 조절할 수 있음을 보여준다 높은 바카라 필승법 농도에서, 유전자는 낮은 바카라 필승법 농도와 비교하여 많은 바카라 필승법에 도입되며 (도 2), 이들 결과는 전자 기계적 기초의 개념을 보여주는 기계적 자극 및 전기 천공의 조합의 영향을 입증한다 또한, 증점제의 첨가로 인한 점도 변화의 평가의 결과로, 두 경우 모두에서 바카라 필승법 현탁액의 점도가 증가하였고, 낮은 바카라 필승법 농도에서 현탁액으로의 두껍게를 투여하면 유전자 전달의 효율이 향상되었다 (도 4) 현탁액의 점도는 마이크로 버블에 의해 바카라 필승법로의 유전자 전달 효율을 증가시키는 데 중요한 요소라고 제안되었다

개발 된 전자 기계적 기초는 다양한 유형의 바카라 필승법에 도입하기 위해 적용되었습니다 구체적으로, 래트 골육종 바카라 필승법주 (UMR-106 바카라 필승법) 및 미세 조류 (Chlamydomonas,Chlamydomonas Reinhardtii)를 사용하여 실험을 수행 하였다 먼저, 상이한 바카라 필승법 농도 또는 증점제를 갖는 UMR-106 바카라 필승법의 현탁액을 제조하고 바카라 필승법 현탁액의 점도를 평가 하였다 도 4에 도시 된 바와 같이, UMR-106 바카라 필승법의 바카라 필승법 농도가 높을 때, 점도가 바카라 필승법 농도가 낮을 ​​때보 다 높고 고농도 현탁액 (21 × 10⁵바카라 필승법/μl)는 기포가 장치 끝에서 진동 함을 보여 주었다 유도 실험의 결과로, 높은 점도 바카라 필승법 현탁액의 경우, 낮은 농도의 바카라 필승법 현탁액에서보다 높은 전달 효율이 달성되었다 (도 4 (b)) 미래에 재생 가능한 바이오 연료의 원천으로 제안 된 또 다른 미세 조류는 두꺼운 바카라 필승법벽 때문에 유 전적으로 조작하기가 어렵다는 것입니다 거대 분자의 예로서, 우리는 2000-kda fitc-dextran을 클라미 도모나에 도입하는 것을 목표로했습니다 2000-kDa의 FITC-Dextran 분자와 혼합 된 샘플에서, 거의 녹색 형광 바카라 필승법가 관찰되었으며, 저농도 현탁액에서 기포 처리가 수행되었을 때도 바카라 필승법로의 소량의 유도만으로도 확인되었다 한편, 고농도의 현탁액을 사용할 때, 기포 처리 동안 FITC-Dextran의 도입이 상당히 증가한 것으로 확인되었다 (도 4C) 따라서,이 시스템은 바카라 필승법벽을 갖는 바카라 필승법 내로 중합체의 도입에 적용될 수 있으며, 샘플의 점도는 식물 바카라 필승법에서도 유전자 전달의 중요한 파라미터라는 것이 밝혀졌다 이것은 전기 기계적 기초를 통해 다양한 바카라 필승법 유형으로 유전자 전달이 달성 될 수 있음을 확인 하였다

제목 : 양도 분자를위한 바카라 필승법의 점도 보조 전자 기계 정책
저자 : Wenjing Huang, Shinya Sakuma, Naotomo Tottori, Shigeo S Sugano 및 Yoko Yamaishi
게시 된 잡지 :칩의 실험실
doi : 101039/d2lc00628f

이 연구는 JST 전략적 크리에이티브 리서치 프로모션 프로젝트 (CREST, JPMJCR19S6)의 지원으로 수행되었습니다

주 1) 핵심 쉘 구조

테플론 튜브에 텅스텐 와이어가있는 구조[참조로 돌아 가기]

참고 2) 방향 전기장으로 인한 기포

전기에 의해 생성 된 직접 기포[참조로 돌아 가기]

참고 3) Mega Dalton

원자 또는 분자의 질량을 나타내는 기존에 사용되는 유닛, 12c의 1/12가 1 Dalton, Part 10⁶더블 장치[참조로 돌아 가기]

참고 4) 전기 천공

짧은 전류 펄스를 사용하여 DNA 및 RNA와 같은 중합체를 바카라 필승법에 도입하는 기술[참조로 돌아 가기]

주 5) CRISPR-CAS 시스템

게놈의 모든 영역을 절단 할 수있는 유전자 변형 도구[참조로 돌아 가기]

참고 6) Expression Vector

유전자 변형 실험에 사용되는 바이러스 및 플라스미드에 구성된 벡터에 대한 일반적인 용어, 유전자 발현에 필요한 프로모터 서열이 통합 부위의 상류 부분에 존재하고, 유전자는 형질 전환 후 바카라 필승법에서 발현된다[참조로 돌아 가기]